DƯỢC - THỰC PHẨM - MÔI TRƯỜNG

Giỏ hàng của bạn

Số sản phẩm: 0

Thành tiền: 0

Xem giỏ hàng

Thống kê

Đang online 54
Hôm nay 72
Hôm qua 55
Trong tuần 127
Trong tháng 2,010
Tổng cộng 65,054

Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR là gì, Xây dựng phòng nuôi cấy mô, phòng thí nghiệm sinh học phân tử

25-09-2013

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách

- Phòng Nuôi cấy mô – bao gồm các phòng sau:
1. Phòng rửa dụng cụ và cất nước
2. Phòng hấp sấy – kho thủy tinh sạch
3. Phòng chuẩn bị môi trường
4. Phòng chuẩn bị khử trùng mẫu
5. Phòng cấy vô trùng
6. Phòng nuôi: phòng nuôi sáng, phòng nuôi tối
7. Phòng sinh hóa
Xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật

Phòng Nuôi cấy mô – bao gồm các phòng sau:
1. Phòng rửa dụng cụ và cất nước
2. Phòng hấp sấy – kho thủy tinh sạch
3. Phòng chuẩn bị môi trường
4. Phòng chuẩn bị khử trùng mẫu
5. Phòng cấy vô trùng
6. Phòng nuôi: phòng nuôi sáng, phòng nuôi tối
7. Phòng sinh hóa
Có thể ghép chung một số phòng với nhau, không nhất thiết là phải đủ 7 phòng riêng biệt.

Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, yêu cầu đối với các phòng như sau:
1. Phòng rửa dụng cụ và cất nước:
Phòng rửa dụng cụ phải có bồn rửa lớn, có đường thoát nước riêng cho axit, có kệ để các thiết bị, có nguồn cung cấp ga, nước, điện. Các dụng cụ cần thiết của phòng này bao gồm:
- Xà phòng, acid chlohydric (HCl) hoặc acid sulphuric
- Dụng cụ rửa pipet, cọ rửa các loại
- Bồn rửa dụng cụ chống hóa chất ăn mòn
- Thùng đựng nước nóng
- Máy cất nước 1 lần: thể tích 4 lít hoặc 8 lít tùy quy mô
- Máy cất nước 2 lần

2. Phòng hấp sấy:
- Có giá kim loại để đựng các ống nghiệm sau khi hấp tiệt trùng
- Nồi hấp tiệt trùng (autoclave)
- Tủ sấy: 30-300oC, dung tích tùy chọn phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm
- Giấy bạc hoặc hộp nhựa đựng dụng cụ để tránh bị tạp nhiễm sau khi hấp tiệt trùng
- Đồng hồ định giờ

3. Phòng chuẩn bị môi trường:
- Cần có tủ đựng hóa chất
- Cân kỹ thuật và/hoặc cân phân tích
- Máy đo pH cầm tay hoặc để bàn
- Máy khuấy từ gia nhiệt
- Tủ lạnh, dung tích tùy chọn
- Lò vi sóng hay bếp để đun nóng môi trường
- Máy rót môi trường (nếu làm trên quy mô lớn thì cần trang bị thêm thiết bị này)
- Các dụng cụ thủy tinh khác

4. Phòng chuẩn bị khử trùng mẫu
- Bồn rửa và bàn để mẫu
- Bình chứa nước cất
- Các hóa chất khử trùng mẫu

5. Phòng cấy vô trùng
Phòng cấy vô trùng trong nuôi cấy mô nên là một phòng rộng khoảng 20 mét vuông, có hai lớp cửa để tránh không khí lưu thông từ ngoài vào trong, sàn, tường được lát gạch men và phòng này cần được vệ sinh, lau chùi thường xuyên để tránh tạp nhiễm. Trong phòng có trang bị đèn UV để khử trùng. Các thiết bị bao gồm:
- Tủ cấy vô trùng, tủ an toàn sinh học: tủ cấy tĩnh, trong tủ có gắn đèn và đèn UV để khử trùng khu vực thao tác.
- Quạt thông gió, thiết bị lọc khí, laminar.
- Giá và bàn để môi trường nuôi cấy mô.
- Các hóa chất cần dùng
- Áo blouse, gang tay, khẩu trang

6. Phòng nuôi cấy mô
Các mẫu sau khi cấy chuyền phải được nuôi trong điều kiện không khí, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp. Phòng nuôi cấy mô có nhiệt độ tùy thuộc vào mẫu cấy và mục đích thí nghiệm. Trong phòng phải được trang bị đèn và hệ thống ánh sáng thích hợp. Ngoài ra cần trang bị thêm máy điều hòa nhiệt độ, các thiết bị và dụng cụ nuôi cấy, tủ ấm.

7. Phòng sinh hóa:
Dùng để tiến hành các phân tích chuyên sâu về sinh hóa, sinh học phân tử để thu nhận số liệu phục vụ công tác nghiên cứu và sản xuất. Tùy thuộc vào kinh phí đầu tư và mục đích thí nghiệm mà có thể trang bị thêm các thiết bị hiện đại như: kính hiển vi có kết nối máy ảnh kỹ thuật số, camera; tủ hút, tủ ấm; cân các loại; máy cắt tiêu bản; máy đo pH; máy ly tâm lạnh; máy PCR, máy realtime PCR; máy chạy sắc ký; máy đo quang phổ; tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu;…
Ngoài ra, cần phải có hệ thống vườn ươm để trồng cây và chọn lọc sau khi nuôi cấy mô.
Phòng thí nghiệm sinh học phân tử – cách xây dựng phòng Lab chuẩn
 
Phòng thí nghiệm sinh học phân tử (phòng thí nghiệm PCR) nên chia thành 2 khu vực riêng biệt:
**1 cho các bước chuẩn bị mẫu trước PCR,
**1 cho các bước phân tích sau khi chạy PCR.
Hai khu vực này tốt nhất là nên nằm tách rời ở 2 phòng riêng biệt. Trong trường hợp không gian bị giới hạn, chỉ cần tách các tủ an toàn sinh học dùng cho PCR ra 1 phòng riêng. Tất cả các trang thiết bị và vật dụng phải dùng riêng cho từng khu vực, không được mang qua lại từ khu này sang khu khác.

Phòng thí nghiệm thực hiện phản ứng PCR:
Phòng thí nghiệm thực hiện PCR dùng trong chẩn đoán các mẫu bệnh phẩm nên được tách thành 3 khu vực trong 3 phòng riêng biệt:
1. Chuẩn bị hóa chất (duy trì áp suất trong phòng cao hơn áp suất môi trường bên ngoài để tránh bị tạp nhiễm từ các nguồn bên ngoài phòng)
2. Chuẩn bị mẫu (duy trì áp suất trong phòng thấp hơn áp suất môi trường bên ngoài để giữ các DNA template bên trong phòng)
3. Khuếch đại và phát hiện sản phẩm (duy trì áp suất trong phòng thấp hơn môi trường bên ngoài để giữ các nucleic acids khuếch đại bên trong phòng)

Làm việc trong phòng thí nghiệm PCR:
Nên tuân thủ theo quy trình làm việc 1 chiều (bên dưới) để giảm thiểu tối đa khả năng tạp nhiễm
 
Phòng chuẩn bị hóa chất
Chuẩn bị PCR master mix, chia nhỏ master mix
 ↓
Phòng chuẩn bị mẫu
(a) Sơ chế mẫu (b) Tách chiết nucleic acids
(c) Cho mẫu vào trong master mix đã được chia theo từng tube
 ↓
Phòng khuếch đại và phát hiện sản phẩm
(a) Chạy PCR (real-time PCR) trên máy luân nhiệt (b) Phát hiện sản phẩm
i. Điện di trên gel (PCR thường)
ii. Quan sát & phân tích kết quả trên máy (real-time PCR)

Thiết bị của phòng thí nghiệm PCR:
Để đảm bảo cho các bước trước PCR và sau khi chạy PCR được tách biệt, mỗi phòng cần có các thiết bị, hóa chất, dụng cụ… riêng và chỉ được sử dụng các vật dụng này trong phòng đó
1. Máy PCR/real-time PCR: Dùng riêng cho phòng khuếch đại
2. Máy ly tâm (centrifuge): Sử dụng máy ly tâm riêng cho chuẩn bị mẫu (tách chiết acid nucleids…) và phòng chuẩn bị hóa chất (optional)
3. Máy ly tâm kéo mẫu (spindown): Sử dụng riêng máy spindown cho phòng chuẩn bị hóa chất, phòng chuẩn bị mẫu, phòng khuếch đại và phát hiện sản phẩm
4. Máy trộn mẫu (vortex mixer): Sử dụng riêng máy vortex cho phòng chuẩn bị hóa chất, phòng chuẩn bị mẫu, phòng khuếch đại và phát hiện sản phẩm
5. Bộ điện di DNA (DNA gel electrophoresis): Dùng để phát hiện sản phẩm sau khi chạy PCR, multiples PCR, RT-PCR…
6. Pipettes: Sử dụng riêng các bộ pipette cho phòng chuẩn bị hóa chất, phòng chuẩn bị mẫu, phòng khuếch đại và phát hiện sản phẩm
7. Tủ thao tác / tủ an toàn sinh học (Biological safety cabinets): Nên sử dụng tủ thao tác phù hợp với nhu cầu của phòng thí nghiệm (theo thiết kế của nhà sản xuất)
 
Loại tủ
Đèn UV
Hệ thống khí
Mục đích sử dụng
PCR cabinet (Type A)
Không
Chỉ dùng cho bước chuẩn bị hóa chất
PCR cabinet (Type B)
Không
Lọc khí vào
Không nên dùng cho các bước chuẩn bị của PCR
PCR cabinet (Type C) /Laminar-flow hood
Lọc khí vào
Chỉ dùng cho bước chuẩn bị hóa chất
Tủ an toàn sinh học cấp I (Class I biological safety cabinet)
Lọc khí thải ra
Không nên dùng cho các bước chuẩn bị của PCR
Tủ an toàn sinh học cấp II, III (Class II or III biological safety cabinet)
Lọc khí vào và lọc khí thải ra
Dùng cho tất cả các bước của PCR


8. Tủ mát có ngăn đông (Refrigerator): Dùng cho phòng khuếch đại và phát hiện sản phẩm để giữ các hóa chất cho điện di, các dung dịch đang sử dụng (working solution), các sản phẩm PCR sau khi đã khuếch đại.
9. Tủ âm (freezer) (-20oC):
- Dùng riêng cho phòng chuẩn bị hóa chất để giữ các hóa chất PCR sạch, buffer, dNTPS, primers…
- Dùng riêng cho phòng chuẩn bị mẫu để giữ mẫu gốc, nucleic acids sau khi tách chiết.
- Bảo quản trong thời gian dài nên sử dụng tủ đông sâu (-80oC) (optional)
10. Cân kỹ thuật (4 số lẻ): Dùng riêng cho phòng chuẩn bị hóa chất và phòng phát hiện sản phẩm
11. Máy khuấy từ: Dùng riêng cho phòng chuẩn bị hóa chất
12. Máy đo pH: Dùng riêng cho phòng chuẩn bị hóa chất
13. Lò vi sóng: Dùng riêng cho phòng phát hiện sản phẩm
14. Máy đọc và chụp ảnh gel (hoặc bàn đèn UV): Dùng riêng cho phòng phát hiện sản phẩm

VẬT TƯ TIÊU HAO:    
1. Pipette tips:
- Có thể dùng đầu tip có lọc để tránh nhiễm chéo
- Tip dùng cho PCR phải vô trùng, RNase-free, DNase-free, pyrogen-free
2. Tube đựng mẫu (1.5 mL) và tube PCR (0.2 mL)
- Tube dùng cho phòng thí nghiệm PCR nên là polypropylene tubes, DNase-, RNase-, pyrogen-free. Tube 0.2 mL dùng cho chạy máy luân nhiệt nên là tube vách mỏng (thin-wall)
3. Găng tay phòng thí nghiệm: Nên sử dụng găng tay không bụi, dùng găng tay trong tất cả các thao tác trong phòng thí nghiệm PCR. Nên thay găng tay khi chuyển từ khu vực phòng này sang phòng khác (phòng chuẩn bị hóa chất –> chuẩn bị mẫu –> khuếch đại…)
4. Dụng cụ thủy tinh: Nên sử dụng loại có thể hấp khử trùng
5. Giá để tube (rack) – nhiệt độ phòng & lạnh

Phòng thí nghiệm PCR: danh mục thiết bị
STT
Tên thiết bị
Số lượng tối thiểu
PHÒNG CHUẨN BỊ HÓA CHẤT
1
Cân kỹ thuật (4 số lẻ)
1
2
Máy khuấy từ
1
3
Máy đo pH
1
4
Tủ thao tác / tủ an toàn sinh học
1
5
Tủ âm (freezer) (-200C)
1
6
Máy ly tâm kéo mẫu (spindown)
1
7
Máy trộn mẫu (vortex mixer)
1
8
Pipettes
1 bộ
PHÒNG CHUẨN BỊ MẪU
1
Cân kỹ thuật
1
2
Tủ thao tác / tủ an toàn sinh học
1
3
Tủ âm (freezer) (-200C)
1
4
Tủ đông sâu (deep freezer) (-800C)
Optional
5
Máy ly tâm (centrifuge)
1
6
Máy ly tâm kéo mẫu (spindown)
1
7
Máy trộn mẫu (vortex mixer)
1
8
Pipettes
1 bộ
PHÒNG KHUẾCH ĐẠI VÀ PHÁT HIỆN MẪU
1
Máy PCR / real-time PCR
1 /1
2
Máy ly tâm kéo mẫu (spindown)
1
3
Máy trộn mẫu (vortex mixer)
1
4
Tủ mát có ngăn đông (Refrigerator)
1
5
Cân kỹ thuật (tối thiểu 4 số)
1
6
Lò vi sóng
2
7
Bộ điện di DNA (DNA gel electrophoresis)
1-2
8
Pipettes
1 bộ
9
Máy đọc và chụp ảnh gel ( hoặc bàn đèn UV)
1
VẬT DỤNG TIÊU HAO
1
Pipette tips
x
2
Tube đựng mẫu (1.5 mL) và tube PCR (0.2 mL)
x
3
Găng tay phòng thí nghiệm
x
4
Dụng cụ thủy tinh
x
5
Giá để tube (rack) – nhiệt độ phòng & lạnh
x
 
 
Realtime PCR hay kỹ thuật Real time PCR là gì?
PCR là phản ứng khuếch đại DNA (polymerase chain reaction). Trong kỹ thuật PCR, sau khi khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả và xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không bằng kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di), hoặc sử dụng thí nghiệm lai với các mẫu dò đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không. Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn phân tích sau khi khuếch đại còn gọi là kỹ thuật PCR cổ điển bằng việc sử dụng máy PCR, hay còn gọi là máy luân nhiệt.
Realtime PCR (Real time PCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR, chính vì vậy mà được gọi là real-time: thời gian thực, và do đặc điểm này mà với kỹ thuật Realtime PCR, người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch đại. Với kỹ thuật real-time PCR sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm là máy realtime pcr, sản phẩm cuối cùng của phản ứng được hiển thị ngay sau khi phản ứng khuếch đại hoàn tất. Vì vậy có thể nói Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được.
Các vấn đề kỹ thuật cơ bản của Realtime PCR:
Biểu đồ khuếch đại của Realtime PCR
Bạn cần tìm hiểu về đường nền (baseline), ngưỡng (threshold), chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct). Ngoài ra bạn cần tìm hiểu thêm về đường chuẩn (standard curve) và hệ số tương quan (R).
 
  
 
Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR
Đường nền (baseline): là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng từ chu kỳ 3 đến chu kỳ 15 và có thể được thay đổi.
Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền.
Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng. Nói khác đi, đó là số chu kỳ của phản ứng realtime PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền.
 
  
 
Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR
 
   
 
 
Đường chuẩn của phản ứng realtime pcr
Đường chuẩn được xây dựng với các nồng độ (pha loãng 5 đến 10 lần) của một trình tự DNA chứng đã biết và các giá trị Ct tương ứng. Đường chuẩn (standard curve): thể hiện mối quan hệ giữa chu kì ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có trong mẫu chuẩn.
Hệ số tương quan (R2): Đánh giá độ chính xác của thao tác hút dung dịch mẫu chuẩn (pipetting) có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt ≥ 0.90 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn phải đạt tuyến tính cao.
Hiệu suất của phản ứng PCR (E%): Hiệu suất phản ứng PCR có thể ảnh hưởng đến chu kỳ ngưỡng.
Để cho kết quả chính xác nhất, bạn nên sử dụng máy realtime PCR chất lượng tốt.